競争的研究費の研究課題 - 塚田　孝祐

胎児循環における物質輸送特性の再評価と胎児心血管系制御システムの解明

2020年04月

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2022年03月

科学研究費助成事業, 毛利 聡, 塚田 孝祐, 花島 章, 橋本 謙, 氏原 嘉洋, 挑戦的研究(開拓), 未設定

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母親の胎内は生後に比べて非常に酸素濃度が低いが、母親と胎児をつなぐ胎児循環（胎盤や血液中で酸素を運ぶヘモグロビン分子）は効率的に酸素を運ぶためのシステムとして捉えられることが多い。しかし胎児のエネルギー消費は大きくなく、過剰な酸素は細胞分裂時に有害にさえなり得る。本研究では胎児循環を胎児細胞の為に最適な低酸素環境を維持し、体を構成するための基質（アミノ酸や脂肪酸）を選択的に運搬する循環システムであると捉え、研究対象として出生後すぐに細胞分裂を止める心筋細胞を扱う。何億年もかけ培ってきた細胞制御システムを分子・細胞・臓器レベルで解明することは、再生医療にも役立つ情報の取得に繋がると期待される。
胎生期の栄養環境が心臓に及ぼす影響を明らかにするため、活発に分裂を繰り返して原始心臓を形成する胎児心筋細胞とアミノ酸環境の関係をラットの培養心筋細胞で検討した。ラットを用いて、胎生20日目、出生後２日目、５日目もしくは６日目、８週齢において、血中および心筋組織中の各種アミノ酸濃度を測定したところ、血中アミノ酸濃度は、Lys，Met，Phe，Trpなどが心筋分裂が盛んな胎生20日目で濃度が高く、出生後には減少した。心筋組織中のアミノ酸濃度は、出生前後で血中ほどの大きな変化はみられなかったが、Leu，Lys，Phe，Valは、出生後にやや減少していた。これらの結果より、ラット胎児の培養心筋細胞を用い、細胞増殖マーカー（Ki67）を指標として心筋細胞分裂能とアミノ酸の関係を検討した。まず胎生20日目の心筋細胞において、単独のアミノ酸での培養を行なった時の分裂能を検討し、分裂能に促進効果のありそうなアミノ酸を探索した。次いで、胎生17日目と胎生20日目の心筋細胞において、心筋分裂に影響のありそうな複数のアミノ酸を除去して培養を行ない、分裂能を検討した。単独アミノ酸培養では、Cys，Gly，His，Lys，Valでの培養が、単独でも、通常培地と同程度の細胞増殖マーカーの陽性率を示した。アミノ酸除去実験では、胎生17日目の心筋細胞においては一度に10種のアミノ酸を除去すると陽性率は有意に減少したが、その他の組み合わせ（３～９種）でははっきりとした陽性率の減少はみられなかった。胎生20日目の心筋細胞では、10種のアミノ酸の除去で陽性率が有意に減少し、Cys・Gly・Ser、His・Ile・Trpの３種、Gly・Lys・Tyr・Valの４種、必須アミノ酸９種の除去で、有意ではなかったが、陽性率が減少する傾向にあった。
胎盤における選択的物質輸送の具体例としてアミノ酸に着目し、成体と胎児血液におけるアミノ酸濃度の違いを確認出来た。心筋細胞培養実験では、アミノ酸の種類によって心筋分裂能の維持に影響の強いものもあったが、特に影響の強いアミノ酸を認めなかった。胎児循環の酸素環境が心臓形成に及ぼす影響に関しては、ポルフィリン燐光を用いた生体微小循環酸素計測システムを構築して臍帯動静脈の酸素分圧を同時に計測しながら母体側の酸素環境を変化させて胎児循環の酸素運搬特性が大量の酸素輸送を目的とするものではなく、成体と比べて著しく低い酸素濃度を維持するための緩衝機構であることを証明する予定であったが、社会的要因から共同実験の進捗が滞り課題が残されたため。
胎児循環のアミノ酸選択的輸送と心筋細胞分裂に関する研究に関しては、アミノ酸配合の様々な組み合わせと心筋細胞分裂能の関係を検証していく。また、胎生期の低栄養環境が心臓に及ぼす影響を解析するため、妊娠15日目から妊娠21日目まで、母ラットに50％摂食制限を施して胎生期低栄養ラットを作成し、自由摂食の母ラットから生まれた仔と出生前後（胎生20日目、出生後1日目、14日目、21日目、30週齢）において、体重、心重量の測定や、心筋組織における心機能関連遺伝子と細胞周期関連遺伝子の発現を比較する。また、胎生期低栄養ラット４週齢において、モノクロタリン（Mct）30mg/kgを皮下投与して肺高血圧症を発症させて、心エコーによる心機能評価や血中ANP濃度測定を行う。また、ポルフィリン燐光を用いた生体微小循環酸素計測システムの構築を進め、胎児循環の酸素環境と胎児心臓形成に関する情報を分子・細胞・個体循環システムでベルで統合的に検討する。

単一細胞の超解像酸素分圧イメージング

2019年04月

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2022年03月

文部科学省・日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 塚田　孝祐, 基盤研究（Ｃ）, 補助金,  研究代表者

AYA世代がん患者に対する性腺組織凍結技術を用いた新たな生殖医療技術の開発

2017年04月

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2020年03月

科学研究費助成事業, 鈴木 直, 杉下 陽堂, 塚田 孝祐, 高江 正道, 基盤研究(B), 未設定

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本邦においても、小児・AYA世代（AYA世代とは、5歳から39歳までの思春期から若年の世代)の一部の女性がん患者に対する、治療開始前の妊孕性温存療法（将来がんを克服した後に子供を授かることができるための治療）が導入されつつある。小児・思春期世代のがん患者にとって唯一の妊孕性温存療法である卵巣組織凍結保存は、10年を超える長期にわたる保管が必要となる。本研究成果によって、長期保管体制におけるヒューマンエラーを防ぐ安全性を担保する新たな保管システムの開発に成功し、さらに長期保管のための耐凍剤の安全性を示す成果を得ることができた。
近年、がん治療の進歩に伴いがんを克服した小児・AYA世代がんサバイバーが増加している。一方、一部のがん治療によって卵巣や精巣の機能が低下することで、将来の患者の妊孕性の喪失（卵子や精子の数が減少し、がん治療後に子供を授かることが不可能になってしまうこと）等を引き起こす場合がある。我々は、小児・AYA世代のがん医療の充実とがんサバイバーシップ向上（将来子供を授かる選択肢を残す試み）に主眼をおいて研究を進めてきた。本研究成果は、①新たな妊孕性温存技術である卵巣組織凍結保存の安全性を明らかにしたこと、②安全な長期保管体制の構築に寄与すること、から学術的・社会的意義が高いものと確信している。

皮膚や臓器に貼付できるフレキシブル酸素イメージングフィルム

2016年04月

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継続中

日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 塚田 孝祐, 基盤研究(C), 補助金,  研究代表者

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生体の皮膚や臓器など凹凸を有する部位でも酸素センシングが可能な貼付型の酸素センサデバイスの開発を行った．酸素センサは酸素感受性色素を含むセンシング層，励起光源層，受光層の3層で構成した．酸素感受性色素をポリスチレンナノ粒子に封入することで，測定精度の向上に成功した．励起光源には電気化学発光を採用し，その電気的条件を決定した．校正実験から有効に酸素計測が可能であることを実証した．将来的には素子を高密度で配列することで酸素濃度の二次元イメージングへの応用が期待された．
酸素濃度を計測する必要性は臨床のみならず，基礎医学研究においても益々増加しているが，現在普及している方法は測定部位が限られるなど利便性に欠けている．そこで従来測定が困難であった立体的な生体組織や培養細胞まで応用できる新たな酸素濃度計測法を提案した．得られた成果を発展させることにより，将来的には手術中に臓器表面に貼付して酸素モニタリングを行うなど，従来不可能であった酸素濃度測定を簡便かつ高精度に測定できると期待された．

近赤外光による新規ワクチンアジュバントのインフルエンザ集団予防接種への適用を目的とするポータブルレーザー医療機器の創出

2016年04月

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継続中

AMED, 橋渡し研究加速ネットワークプログラム, 補助金,  研究代表者

組織低酸素イメージングセンサの開発と造影剤投与不要な初期がん検出への実用

2015年04月

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2016年03月

中谷医工計測技術振興財団, 補助金,  未設定

近赤外レーザによる物理的免疫アジュバントの確立：生体の新たな光感受機構の探求

2014年04月

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2015年03月

日本学術振興会, 補助金,  研究代表者

転移性腫瘍の早期検出を目的とした無侵襲光計測法の開発と医療への展開

2011年04月

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2012年03月

医科学応用研究財団, 補助金,  未設定

近赤外ラマン分光法による生体内ガス分子動態の可視化と腫瘍検出技術への応用

2010年04月

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2012年03月

日本学術振興会, 補助金,  未設定